Hatshepsut là con gái lớn của vua Thutmose I và Vương hậu Ahmose. Cặp vợ chồng này là vua và Vương hậu đầu tiên của dòng họ Thutmosid thời Vương triều thứ mười tám. Thutmose I và Ahmose được biết chỉ có một người con trai, một người con gái là Akhbetneferu (Neferubity) đã chết khi còn trẻ. Thutmose I cũng cưới Mutnofret - có lẽ là con gái của Ahmose I - và sinh ra nhiều anh em cùng cha khác mẹ với Hatshepsut: Wadjmose, Amenose, Thutmose II, và có lẽ Ramose, trong cuộc hôn nhân thứ hai này. Cả Wadjmose và Amenose đều được chuẩn bị để nối ngôi cha, nhưng không người nào sống qua tuổi thanh niên.

Khi vua cha Thutmose I mất năm 1493 trước Công Nguyên, Hatshepsut cưới người em cùng cha khác mẹ là Thutmose II, và lấy danh hiệu Đại Phu nhân Hoàng gia. pharaon Thutmose II cai trị Ai Cập trong ba hay mười ba năm.Phụ Nữ vương gia cũng đóng một vai trò chủ chốt trong tôn giáo Ai Cập cổ đại. Thông thường một Vương hậu có nhiệm vụ trong các nghi lễ tại các đền, như các nữ tu, trong một nền văn hoá nơi tôn giáo hoàn toàn trộn lẫn với các vai trò của các nhà cai trị. Ở thời Hatshepsut, con gái các vị vua thường hoạt động trong vai trò Vợ Thần (tượng hình:ḥmt nṯr), đó là một vai trò thần thánh thường được đảm nhiệm bởi những phụ Nữ vương gia ở Vương triều thứ mười tám.[7]

Hatshepsut có một con gái với Thutmose II là Neferure. Một số học giả cho rằng Hatshepsut và Thutmose II đã chuẩn bị cho Neferure trở thành người kế vị, thực hiện các bức chân dung chính thức của con gái họ với một bộ râu giả của Hoàng gia và món tóc bên như được thấy ở những bức điêu khắc, chạm nổi và bức vẽ còn lại. Có nhiều hình ảnh của bà với người vú và các giám hộ trong các bảo tàng.

Khi Thutmose II mất, ông chỉ có một người con trai còn trẻ, Thutmose III, để kế vị. Thutmose III là con trai của Isis - một người thiếp của Thutmose II, chứ không phải của Đại Phu nhân Hoàng gia, Hatshepsut, như Neferure. Vì Thutmose III còn khá trẻ, ông không thể thực hiện các nhiệm vụ của một pharaon. Thay vào đó, Hatshepsut trở thành nhiếp chính của Ai Cập ở thời điểm đó, nắm các trách nhiệm nhà nước, và được công nhận bởi giới lãnh đạo tôn giáo. Thời điểm đó, con gái bà, Neferure, nắm vai trò của Hatshepsut từng đảm nhiệm trở thành Nữ vương trong các nghi lễ tôn giáo. Sự sắp xếp chính trị này được miêu tả chi tiết trong các bản khắc trong hầm mộ của Ineni, một quan chức cao cấp trong triều:

Vì thế, tuy Thutmose III được coi là người đồng nhiếp chính Ai Cập, triều đình Ai Cậpcông nhận Hatshepsut như là pharaon trên ngôi cho tới khi bà qua đời. Mọi người tin rằng Neferure đã chết trước mẹ bởi những miêu tả về bà biến mất trước khi thời kỳ cầm quyền của vị Nữ vương Ai Cập kết thúc.

pharaon Thutmose III trị quốc trong hơn ba mươi năm sau khi Hatshepsut mất. Mối quan hệ này giữa Neferure và Amenemhat đang bị giới học giả tranh luận, nhưng bởi Neferure được thể hiện trong đền chôn cất mẹ bà, có một số người tin rằng Neferure vẫn còn sống vài năm sau trong thời kỳ cai trị của Thutmose III, rằng con trai lớn của ông, Amenemhat, là con bà, và rằng vì thế ông là người kế vị ngôi báu của Thutmose III cho tới khi ông mất.[9]